rtpcr和普通pcr區(qū)別

半定量RT-PCR與定量RT-PCR的區(qū)別是半定量RT-PCR操作簡便，可快速推測樣品中特異mRNA的相對數(shù)量；而定量RT-PCB可實時定量，較半定RT-PCB更準(zhǔn)確。

1. 半定量反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是近年來常用的一種簡捷、特異的定量RNA測定方法，通過mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行PCR擴增，并測定PCR產(chǎn)物的數(shù)量，可以推測樣品中特異mRNA的相對數(shù)量。

2. 定量RT-PCR（quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR）是在用一步法或兩步法，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。

半定量RT-PCR與定量RT-PCR的區(qū)別是半定量RT-PCR操作簡便，可快速推測樣品中特異mRNA的相對數(shù)量；而定量RT-PCB可實時定量，較半定RT-PCB更準(zhǔn)確。

半定量反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是近年來常用的一種簡捷、特異的定量RNA測定方法，通過mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行PCR擴增，并測定PCR產(chǎn)物的數(shù)量，可以推測樣品中特異mRNA的相對數(shù)量。

定量RT-PCR（quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR）是在用一步法或兩步法，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。

半定量RT-PCR需要跑電泳，根據(jù)條帶亮度的強弱來判斷模板拷貝數(shù)的高低或者是表達量的高低，而定量RT-PCR則無需電泳可以實時監(jiān)測整個PCR的全程并且由給出的Ct值及Standard Curve來判斷gene拷貝數(shù)的高低。

熒光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用來檢測基因的表達量的,但二者檢測的東西多少有些不同.BIOG染料法熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入可以和雙鏈DNA特異性結(jié)合的熒光染料或者和目的DNA片段結(jié)合的BIOG taqman,通過監(jiān)控PCR過程中的熒光的變化,并且和某些管家基因的熒光變化進行對比反應(yīng)出目標(biāo)基因的表達量.熒光定量PCR的主要有效數(shù)據(jù)是熒光信號增長到最大值的一半時的時間.半定量RT-PCR則是通過RT-PCR最終產(chǎn)物電泳后電泳條帶的明暗來間接反應(yīng)出原始模板的豐度.熒光定量PCR因為是全程監(jiān)控PCR擴增的變化,并且能夠同管家基因的擴增曲線進行相對定量,而將基因的表達量數(shù)值化,準(zhǔn)確度高于半定量RT-PCR.半定量RT-PCR因為是監(jiān)控的最終產(chǎn)物,而在基因表達水平很高的時候,PCR體系很可能在反應(yīng)中后期就飽和了,所以對于高水平表達的基因來說,用半定量RT-PCR并不能很準(zhǔn)確的說明問題.

半定量rt-pcr參照的做法一般有兩種：

1)將要比較的兩個樣品的beta-actin 調(diào)成一樣的亮度，然后就可以直接比較目的基因的亮度了。方法的結(jié)果比較直觀，但較費事。

2)不進行調(diào)平，一個樣品里將目的基因和beta-actin直接比較，用軟件就可以做到，然后將不同樣品的這個比值進行比較就可以了。方法比較簡單，但結(jié)果不夠直觀。

1.每個標(biāo)本都要做自己的內(nèi)參，不能用同一個內(nèi)參！

2.每個標(biāo)本在實際做前都要摸最佳循環(huán)數(shù)，包括內(nèi)參，但內(nèi)參的循環(huán)數(shù)不一定要和目的基因一樣，都要選擇上升期的中間數(shù)作為最佳循環(huán)數(shù)，否則進入平臺期就沒有可比性了！所以內(nèi)參要有它自己的最佳循環(huán)數(shù)！

3.電泳掃描后，計算灰度值，先用同一標(biāo)本的內(nèi)參和目的進行比較，然后用這個相對值再去和其他你所要比較的平行組進行比較，一般每組4個樣本以上。

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